细胞是生命的基石。一些细胞类型好单独生长，悬浮。但是，细胞中的大多数是整合在较大3D基体（如组织）中的粘附细胞。这些细胞与同一组织中的相邻细胞或与相邻却不同组织的界面处的相邻细胞相互作用。这可以是肌腱和骨骼之间的自然界面，或者对于植入物或生物膜而言，可以是人造界面。控制细胞-基体和细胞-细胞相互作用的力对其结构和功能很重要，对其量化可以更好地了解组织和界面的机械强度以及其中的相关故障。为此，单细胞力谱测量是一个强有力的工具。

Flex-FPM — 单细胞粘附力光谱的标准工具

原子力显微镜（AFM）已被广泛地用于研究单细胞水平上的细胞-基体和细胞-细胞相互作用[Helenius et al.(2008), Moreno-Encerrado et al.(2017)]。 执行单细胞力谱时细胞通常被化学绑定到悬臂上。但是，此方法存在一些缺点。化学绑定将可获得的大粘附力限制在几百纳牛顿。此外，它需要很多悬臂才能获得结论性的结果。当在延长的孵育时间（数小时至数天）后研究粘附细胞时，此力范围的限制尤其麻烦，因为力可能超过微牛顿范围。在研究细胞的融合层时尤其如此。在这里，除了通常研究的基体粘附以外，细胞与细胞之间的相互作用力也有贡献。

Fig. 1: 使用FluidFM技术，Flex-FPM 扩展了FlexAFM的功能: 使用空心悬臂进行局部样品操作

Flex-FPM (Fig. 1) 克服了这两个主要限制。Flex-FPM是结合了FlexAFM 原子力显微镜和FluidFM的灵活工具。细胞粘附测量是在ETH苏黎世由Prof. Julia Vorholt 和 Dr. Tomaso Zambelli小组率先开始的。使用 FluidFM™技术，不同细胞类型可通过悬臂内管道的负压被附在悬臂上。已证明FluidFM可测量许多不同细胞类型（例如哺乳动物细胞，酵母细胞和细菌细胞）的细胞基体粘附力。与化学绑定相比，使用FluidFM仅需几秒钟的接触时间即可施加大得多的力。 哺乳动物的细胞基体粘附的可觉察分离力大概达到几微牛顿范围[Potthoff et al. (2012); Potthoff et al. (2014)]. 不同表面纹理上的数据集显示细胞基体粘附与表面纹理深度的强烈相关性。这些粘附力测量可以帮助表面纹理的合理设计，以改善心血管植入物如具有内皮细胞的支架的覆盖率。这种内皮化对于防止血液与异物的相互作用至关重要。内皮化不足会导致炎症反应，急性血栓形成或慢性狭窄，即边缘腔变窄[Potthoff et al. (2014)]. 尽管力很大，力的分辨率仍然足以测量来自细胞外基质的单膜系链的粘附力。例如，用于单细胞力谱实验以研究细菌粘附力[Potthoff et al. (2015)].

通过抽吸法的附着不仅牢固而快速，而且是可逆的。因此，相同的FluidFM&trade探针可以连续用于多个细胞。曾经使用一个悬臂测量了超过200种不同的酵母细胞。这是在变化的环境条件下一天内完成的[Potthoff et al. (2012)]。使用倒置光学显微镜可以轻松进行细胞选择。使用荧光标记根据细胞的形状（形态），细胞大小或特定蛋白质的存在来选择细胞。同样对于哺乳动物细胞，实验量也高于化学绑定法。哺乳动物细胞的细胞表面与悬臂的相互作用比酵母细胞的相互作用更为复杂。这会导致更多的非特异性粘附，因此需要在实验之间清洁悬臂。业界已经建立了使用胰蛋白酶以酶促方式清洁悬臂的方案[Potthoff et al. (2014)]或用化学方法在次氯酸钠溶液中清洁[Jaatinen et al. (2016)]。清洁后，新的细胞可直接吸附，而无需像常规化学绑定时要有的涂覆步骤。

细胞-细胞粘附力

最近，结合原子力显微镜以及微流控中控探针技术的FluidFM™细胞粘附力测量已扩展到研究细胞间的相互作用。这可以是细胞（在悬臂上）和下面的基体上细胞之间的力（图2A），也可以是细胞与融合层中其周围细胞之间的力（图2B）。

Fig. 2: 细胞-细胞 相互作用 (红色弹簧)通过将单细胞吸入空心FluidFM™探针(橙色)来研究。A) 探测固定在悬臂上的细胞和基质上的细胞之间的力， B) 从融合层中挑选单个细胞，探测细胞 - 基质（紫色）和细胞 - 细胞（红色）相互作用。

波士顿东北大学Prof. Tanya Konry 小组的Dr. Noa Cohen 用Flex-FPM系统研究细胞间粘附力，以更深入地了解肿瘤的进展和转移情况 [Cohen 等 (2017)].

Figure 3 显示了 fig. 2 A 中描述的方法的光学图像，它被 Cohen 用于本研究。

细胞被吸上悬臂探针 C)吸有细胞的FluidFM探针在细胞间粘附测量中。

Fig. 3: 光学图像显示 A) 一个单细胞被FluidFM探针拾取 B)细胞被吸上悬臂探针 C)吸有细胞的FluidFM探针在细胞间粘附测量中。数据由美国波士顿西北大学 Tanya Konry 小组提供

将单个MCF7乳腺癌细胞固定在悬臂上。然后将细胞推到固定在基质上的不同细胞类型上。发现MCF7癌细胞与不同细胞类型之间测量的细胞粘附力随着培养时间而有不同的发展。在这些实验中，细胞的可逆结合使得可以用相同的探针来测不同的细胞间力(图4)，从而更好地比较测量值。

Fig. 4 A) 吸上探针的MCF7细胞与基体上非癌性成纤维细胞(HS5)在不同接触时间下的典型力曲线。B) 随着细胞之间接触时间的增加，力的发展。数据由美国波士顿西北大学 Tanya Konry 小组提供。

来自维尔茨堡大学Prof. Jürgen Groll小组的Dr. Ana Sancho广泛研究了上皮细胞融合层中细胞与其相邻细胞之间的相互作用（图2B）[Sancho et al. (2017)]. 图5显示悬臂从融合层（A）拾取细胞。拾取后，可以看到原细胞位置的空白区域（B）。同样，可以使用倒置显微镜基于细胞大小和细胞形状来选择感兴趣的上皮细胞。

Fig. 5: 细胞的聚集层，其中一个被FluidFM拉出，改编自: Sancho 等 (2017), Scientific Reports volume 7, 46152.

我们发现来自脐动脉的人类内皮细胞具有强大的细胞间力(图6A和B)。通过过量所谓的 (MSX1)蛋白可以显著降低这种细胞间力。MSX1诱导内皮细胞向间质转化。这种转变涉及心血管发育和发病的过程。除了这些粘附实验之外，Flex-FPM系统还被用于纳米压痕测量。在此情况下，悬臂吸附胶体珠并记录在细胞上的力曲线。

Fig. 6: A) 单个细胞或聚集层中细胞的典型单细胞力曲线，描绘了细胞间相互作用引起粘附力增加。 B）MSX1对单个细胞和单层细胞中观察到的细胞粘附力的影响。 灰色和黑色条形：分别对单个细胞和单层细胞进行的对照测量，浅蓝色和浅白色分别是经MSX1处理的单个细胞和单层细胞。 改编自: Sancho 等. (2017), Scientific Reports volume 7, 46152.

这两个例子都大大得益于 Flex-FPM提供的 FluidFM™ 技术。在融合层的情况下，高达1.5μN以上的粘附力消除了化学绑定力以研究细胞间粘附力。在这两例情况下，可逆的结合为实验提供了必要的省时以获得足够的统计数据。